非编码RNA

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　　非编码RNA（Non-coding RNA）是指不编码卵白质的RNA，包罗miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等。非编码RNA施展功效的方式许多，可以与卵白、DNA和RNA相互作用，加入多种细胞运动，主要包罗基因的激活和默然沉静，RNA的剪接、修饰和编辑，卵白质的翻译等。

　　

　　1.miRNA：miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中加入转录后基因表达调控。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调治统一个基因。

　　

图一 miRNA成熟及作用方式（Mikhailidis DP, Athyros VG. Nat Rev Cardiol. 2014 Feb;11(2):72-4.）

　　

　　 miRNA过表达：将miRNA前体序列构建入病毒载体中，gai载体既可用于瞬时转染细胞，也可以包装成病毒用于稳固株筛选和动物水平过表达miRNA。

　　

　　miRNA敲低：设计针对miRNA的TuD RNA关闭片断或海绵片断，再将gai片断构建入病毒载体中。gai载体除了可以直接瞬时转染细胞用于miRNA的敲低，也可以包装成慢病毒，用于动物水平敲低miRNA。

　　

　　miRNA靶基因展望：miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶基因的3’UTR区，并凭证互补水平的差异指导默然沉静复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。因此，可以将目的基因的3’UTR区域构建到含luciferase的陈诉基因上，通过较量miRNA过表达或inhibitor 与陈诉基因作用检测荧光值的转变，判断miRNA对靶基因的作用。再通过对3’UTR区举行定点突变的要领进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

　　

　　miRNA常用数据库：

　　

　　 （1）miRbase（http://www.mirbase.org）：miRbase 是由曼彻斯特大学的研究人yuan开发的一个在线的miRNA数据库，提供包罗已揭晓的miRNA序列数据、注释、展望基因靶标等信息的全方位数据库，是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一。

　　

　。2）TargetScan（http://www.targetscan.org/）：TargetScan是通过搜索和每条miRNA种子区域匹配的守旧的8mer和7mer位点来展望靶基因。

　　

　。3）TarBase（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex）：TarBase数据库人工履历了长达10年左右的时间去搜集了实验验证过的miRNA的靶基因，包罗在人、小鼠、果蝇、蠕虫和斑马鱼中的miRNA的靶基因。

　　

　。4）miRWalk（http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/）：miRWalkis是一个综合性数据库，提供来自人类、小鼠和大鼠的miRNA的展望信息和经由验证的位于其靶基因上的结位点。

　　

　　2.lncRNA：lncRNA是长链非编码RNA（long non-coding RNA）的简称，是长度在200-100000 nt之间的RNA分子。大多数的lncRNAs在组织分化发育历程中，都具有显着的时空表达特异性；序列上守旧性较低，只有约12%的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到。

　　

　　凭证lncRNA在基因组上相对于卵白编码基因的位置，可以将其分为启动子区（promoter associated）、内含子间（intronic）、双向（bidirectional）、正义链（sense）、反义链（antisense）、3’UTR区（3’UTR associated）、基因间（intergenic）这7种类型。这种位置关系对于推测lncRNA的功效有很大资助。

　　

　　图二 lncRNA分类（Huang X, et al.Cancer Lett. 2018 Jan 28;413:94-101.）

　　

　　一ban来说，lncRNA主要从以下三种层面实现对基因表达的调控：

　　

　　（1）表观遗传学调控：lncRNA招募染色质重构复合体到特定位点进而介导相关基因的表达默然沉静。

　　

　　（2）转录调控：包罗如下几种：1）lncRNA的转录能够滋扰邻近基因的表达；2）lncRNA能够通过封阻启动子区域来滋扰基因的表达；3）lncRNA能够与RNA团结卵白作用，并将其定位到基因启动子区从而调控基因的表达；4）lncRNA能够调治转录因子的活性；5）lncRNA也能够通过调治基本转录因子来实现调控基因的表达。

　　

　　（3）转录后调控：lncRNA能够在转录后水平通过与mRNA形成双链的形式调控基因的表达。

　　

　　lncRNA过表达：将lncRNA序列构建入病毒载体中，gai载体既可用于瞬时转染细胞，也可以包装成病毒用于稳固株筛选和动物水平过表达lncRNA。

　　

　　lncRNA滋扰：针对lncRNA设计滋扰片断，再将gai片断构建入病毒载体中。gai载体除了可以直接瞬时转染细胞用于lncRNA的滋扰，也可以包装成慢病毒，用于动物水平滋扰lncRNA。

　　

　　lncRNA敲除：用CRISPR/Cas9手艺对lncRNA举行敲除。针对lncRNA某条片断的两头划分设计多条sgRNA序列，实现大片堆池佣酱锴贸男Ч。将sgRNA序列构建入病毒载体中，再将Cas9序列装入另一载体中，随后两种病毒同时熏染目的细胞举行敲除。

　　

　　lncRNA靶基因寻找：要领基本类似于上面表述的miRNA双荧光素酶检测。

　　

　　3.circRNA: circRNA即环形RNA（circular RNA）的简称，是一类不具有5’最后帽子和3’ 最后poly（A）尾巴、并以共价jian形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子。

　　

　　circRNA主要特征：

　　

　　（1）circRNA由特殊可变剪切发生，大量存在与真核细胞的细胞质中，主要泉源于外显子，少部门内含子泉源的circRNA存在细胞核中。

　　

　。2）表达水平具有种属、组织、时间特异性。

　　

　。3）circRNA呈闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，比线性RNA越发稳固。

　　

　。4）具有一定序列守旧性。

　　

　。5）在转录或转录后水平施展调控作用。

　　

　。6）绝大多数circRNA是非编码的，但也有少数可以翻译为多肽。

　　

　　circRNA凭证其泉源可分为三类：外显子泉源的circRNA（exonic circRNAs），内含子泉源的circRNA（circular intronic RNAs，ciRNAs），以及由外显子和内含子配合组成的circRNA（retained-intron circRNAs）。

　　

　　circRNA的作用机制：

　　

　　miRNA分子海绵，circRNA含有大量的miRNA团结位点，具有miRNA海绵作用，进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。

 

　　
 

　　调控基因转录，circRNA也可以通过与RNA团结卵白的团结来调控卵白功效，好比通过与转录因子的团结来抑制基因的转录。

　　

　　编码功效，circRNA虽然属于非编码RNA，可是也有少数circRNA可襶uan嗦攵嚯，通过gai多肽行使调控功效。

　　

　　circRNA过表达：同上述的lncRNA步骤类似，可是circRNA过表达由于成环效率的影响，其难度相对通俗基因的过表达更大。

　　

　　circRNA滋扰：同上述的lncRNA要领步骤。

　　

　　circRNA敲除：同上述的lncRNA要领步骤。

　　

　　circRNA靶基因寻找：同上述的miRNA和lncRNA双荧光素酶检测要领。

　　

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